H9c2（2-1）是由B.Kimes和B.Brandt從胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生的原始克隆細胞系的亞克隆，并且表現(xiàn)出骨骼肌的許多特性。該系中的成肌細胞將融合形成多核肌管并響應乙酰膽堿刺激。如果培養(yǎng)基中的血清濃度降至1％，則融合發(fā)生得更快。

　　一、大鼠心肌細胞H9C2試劑配制：

　　（1）PBS磷酸鹽緩沖液：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，121℃，30min高壓滅菌，4℃冰箱保存。

　?。?）DMEM-F12細胞生長培養(yǎng)液：臨用前根據(jù)需要按體積比10%加胎牛血清，最后按1％體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100U/mL，置于4℃冰箱保存。

　　(3)心肌細胞培養(yǎng)基：DMEM/F12+10%胎牛血清（Hyclone）+1%雙抗+Brdu(終濃度為0.1mmol/L)，0.2um一次性過濾器過濾除菌，制備100ml，現(xiàn)配先用。

　?。?）0.125%胰酶消化液：將實驗室現(xiàn)有的0.25%胰酶消化液用蒸餾水稀釋2倍。

　　二、大鼠心肌細胞H9C2實驗步驟：

　　（1）取出生7d內(nèi)新生乳大鼠，燒杯裝載放入細胞間，另準備75%酒精，先用鑷子使乳鼠頸部脫臼致死，在75%酒精中浸泡至少1min，然后固定在泡沫板上，先用碘酒消毒胸腹部，再用酒精消毒。取出無菌剪刀和鑷子，先用酒精棉球再次消毒，剪開胸，取心尖部位，快速置于含雙抗的預冷的PBS溶液潤洗3次。

　　（2）剔除周圍結締組織，將心臟置于無菌平皿中，將心臟盡量剪碎，平皿內(nèi)加入適量0.125%的胰酶，在37℃培養(yǎng)箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。

　　（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM/F12培養(yǎng)基，輕輕混勻，中和胰酶的消化，防止消化過度。用200目細胞過濾篩子過濾含細胞的混合液，最后將過濾后的細胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀，用PBS再次重復離心3次。用細胞培養(yǎng)基將細胞沉淀重懸，接種于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

　?。?）培養(yǎng)90min左右，將未貼壁的細胞懸液吸出。此時已經(jīng)貼壁的是心肌成纖維細胞。

　?。?）將未貼壁的細胞懸液放入新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并每日觀察心肌細胞的生長。